Las toxinas bacterianas

Jaime Garrido
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El descubrimiento de las toxinas fue paralelo al descubrimiento de los principales microorganismos infecciosos humanos. A finales del siglo XIX y principio del siglo XX se identificaron los primeros patógenos y se observó que cuando se cultivaban en un medio líquido, el sobrenadante era capaz por sí solo de producir la enfermedad.

Se le dio el nombre de toxina a la proteína bacteriana que se secreta al medio y es capaz de producir daños en los organismos vivos.

La primera toxina que se identifico fue la de Corynebacterium diphtheriae, y se tardo unos 7 años en producir su vacuna. La principal aplicación de las toxinas es la fabricación de toxoides (vacunas), pero también tiene gran interés desde el punto de vista básico porque ha sido y es una herramienta fundamental en la investigación básica para conocer el funcionamiento de las células eucariotas.

Las toxinas constituyen el nexo de unión de todas las áreas de la Microbiología Celular.

Que es una toxina y clasificación de las toxinas

Una toxina es una molécula de origen bacteriano, normalmente de naturaleza proteica, causante de los daños a las células y tejidos del hospedador, que conducen a la enfermedad.

Atendiendo a si se liberan al medio durante la vida de la bacteria o lo hacen sólo cuando muere y se lisa, las toxinas se clasifican en exotoxinas y endotoxinas respectivamente.

Las exotoxinas son proteínas bacterianas no estructurales que reconocen receptores específicos en células diana. Normalmente se liberan al medio a medida que la bacteria crece.

Las endotoxinas suelen ser componentes estructurales de la bacteria que se liberan al medio cuando esta muere. El prototipo de endotoxina es el lípido A del lipopolisacárido (LPS) de las Gram.

En la composición del LPS de las bacterias Gram sólo la parte del lípido A es tóxica, el resto del LPS es lo que hace soluble a este lípido. La estructura del LPS O es característica de cada bacteria.

Lipopolisacarido Lípido A

Las bacterias Gram+ no poseen el lípido A y por tanto no producen endotoxinas.

Esta definición no está exenta de excepciones porque por ejemplo, la exotoxina botulínica no se libera cuando la bacteria crece.

Características de las exotocinas y endotoxinas

En la tabla anterior se recogen las diferencias entre ambos tipos de toxinas y sus características principales. Las exotoxinas tienen efectos diversos pero las endotoxinas tienen siempre los mismos efectos. Las exotoxinas reconocen dianas específicas de la célula eucariota, mientras que las endotoxinas ejercen un efecto general o sistémico sobre el organismo.

La toxicidad de la toxina botulínica se mide en unidades funcionales o unidades ratón (U), que se corresponden a la dosis letal media (DL50) para unos ratones conocidos como Webster que tienen un peso de entre 18 y 20 gramos y corresponde a una unidad por cada 0,05 ng de peso.

La dosis letal en humanos no se conoce, pero extrapolada a partir de datos de experimentos en monos, para un humano de 70 kg de peso, sería de 0.09-0.15 picogramos de toxina por vía intravenosa o intramuscular, 0.70-0.90 picogramos por inhalación y 70 µg por vía oral. Un solo gramo de toxina botulínica es suficiente para matar a un millón de cobayas, y para matar a un ratón de laboratorio es necesario un picogramo de botulina.

Las toxinas también se pueden clasificar en función de la localización de su diana:

dianas de las toxinas

Entre las toxinas que actúan sobre la superficie de la membrana están las que no producen daño a la misma y las que dañan la membrana mediante la formación de poros, o las que enzimáticamente interfieren las rutas de señalización.

Entre las que actúan en el interior sin dañar la membrana se encuentran las toxinas que se internalizan por endocitosis y las que se inyectan directamente.

Endotoxinas

Las exotoxinas son muy específicas, pero las endotoxinas no lo son, tienen un efecto muy general y suelen actuar activando el factor sanguíneo de Hageman (factor sanguíneo XII) el cual provoca:

  • El inicio de la cascada de coagulación, es decir, la transformación del fibrinógeno en fibrina, lo que da lugar a una coagulación de la sangre y la producción de trombosis, y la coagulación intravascular diseminada, no controlada, que acabará por agotar todos los factores de coagulación, produciendo al final una hemorragia.
  • Activa las proteínas del complemento de defensa frente a patógenos, liberándose mediadores de la inflamación.
  • Activa la fibrinólisis, activándose el sistema del plasminógeno y produciendo así plasmina. La plasmina disuelve los coágulos sanguíneos y contribuye a la hemorragia.
  • Activa al sistema del bradicinógeno, produciéndose una liberación de bradicinina, que es un péptido vasodilatador que provoca así una bajada brusca de la tensión pudiendo llegar a causar un shock hipovolémico (pérdida severa de sangre y líquido) que produce la muerte.
efectos de las endotoxinas

Las endotoxinas representan un grave problema en la industria farmacéutica, por consiguiente hay un control muy exhaustivo para asegurar la ausencia de endotoxinas en todos los medicamentos y utensilios médicos.

Las exotoxinas bacterianas pueden contribuir de tres formas distintas en el desarrollo de la enfermedad, como podemos ver en la siguiente imagen:

contribución de las exotoxinas en la enfermedad

Test de detección de endotoxinas: Prueba del Limulus

Para detectar la presencia de endotoxinas se utiliza el llamado cangrejo en herradura (Limulus polyphemus) del cual se extraen amebocitos. Esos amebocitos contienen una enzima coagulante que en presencia de endotoxina se activa y rompe el procoagulógeno en coagulógeno.

El coagulógeno coagula (precipita), volviendo turbia la preparación. Se mide su densidad óptica para determinar la cantidad de endotoxina del preparado.

endotoxinas coáguogeno

Toxinas que actúan en la superficie de la célula hospedadora

Las toxinas que producen poros en la membrana celular suelen ser proteínas que presentan dos estados distintos según se encuentren insertadas en la membrana o estén en el medio intercelular.

Todas las toxinas que actúan en la superficie de la célula comparten la propiedad de ser moléculas anfipáticas con un dominio hidrofílico que le permite adquirir una estructura soluble y otro hidrofóbico que le permite insertarse en la membrana.

A estas toxinas también se les llama hemolisinas porque pueden hacer poros en los glóbulos rojos y lisarlos, pero estos no suelen ser su diana habitual e incluso pueden no tener el mismo efecto en sus verdaderas células diana. Su objetivo no es necesariamente lisar la célula, sino que también pueden matarla induciendo la apoptosis, o por la alteración de señales celulares mediante la producción de citoquinas, etc.

Como se mencionó en el tema anterior, estas toxinas pueden formar poros grandes, de unos 35 nm de diámetro, y poros pequeños de 1-2 nm de diámetro.

Toxinas que hacen poros de gran tamaño: la estreptolisina O.

Entre los géneros de bacterias más conocidos que hacen poros grandes en la membrana celular se encuentran:

  • Streptococcus. S. pyogenes que produce la toxina estreptolisina O (asociada a enfermedades de tipo reumático), y S. pneumoniae que produce la pneumolisina (asociada a neumonías).
  • Bacillus. B. cereus que produce la toxina cereolisina O, y B. thuringiensis que produce la thuringiolisina O.

Clostridium. C. tetani que produce la toxina tetanolisina, C. botulinum que produce la botulisina, y C. perfringens que produce perfringolisina (asociada a la gangrena). Listeria. L. monocytogenes que produce la toxina listeriolisina O.

toxinas formadoras de poros

Este tipo de toxinas es producido sólo por bacterias Gram+. Son toxinas que oligomerizan sobre la membrana para producir el poro, el cual puede tener un diámetro de hasta 35 nm. Cada subunidad tiene un dominio hidrofílico y otro hidrofóbico.

Se les llama también toxinas de unión a colesterol activadas por tioles, porque se insertan en membranas ricas en colesterol (el colesterol actúa como receptor) y porque se creía que estaban activadas por tioles (ahora se sabe que esto último no es cierto porque no necesariamente necesitan un residuo de cisteína para activarse sino que pueden ser activadas por otros residuos).

Toxinas creadoras de poros pequeños.

Los poros suelen tener 1 o 2 nm de diámetro y son producidos por bacterias Gram+ y Gram.

Destacaremos dos tipos muy importantes:

Toxinas RTX

Posee una estructura polipeptídica con una región con repeticiones de un nonapéptido rico en glicina en su centro (4-47 repeticiones). Esta región es la que participa en la formación del poro. Es dependiente de calcio. También tiene una región rica en aminoácidos hidrofóbicos. El extremo amino-terminal le da la propiedad anfipática y es helicoidal. En el extremo carboxi-terminal tienen el péptido señal.

La familia de toxinas RTX son citotoxinas con una estructura muy bien conservada, que poseen nonapéptidos ricos en glicina repetidos en tandem, en número distinto según el tipo. Su secreción se produce después del reconocimiento de una secuencia señal que está situada en el extremo C-terminal de la proteína, mediante la intervención de un sistema de secreción de tipo I. La toxina de referencia de este grupo de sustancias es la a-hemolisina producida por Escherichia coli (HlyA) y, además, se incluyen también otras como la producida por Bordetella pertussis (CyaA), entre otras, que presenta un mayor tamaño en la región cyaA porque contiene adenilato ciclasa.

Los genes B y D son necesarios para la secreción y el gen C para la activación. Intervienen unos 7 monómeros para hacer el poro. Esta toxina se sintetiza en una forma inactiva (prototoxina) que se activa por un ácido graso unido gracias a una proteína de acilación. Su síntesis está regulada por un operón de genes RTX reguladores.

genes rtx

α-toxina de Staphylococcus aureus

Es responsable de la α-hemolisis. Tiene una estructura totalmente distinta a la anterior. Se secreta ya activada y su zona central tiene unos 20 aminoácidos hidrofóbicos que cuando disminuye el pH se exponen hacia el exterior y se insertan en la membrana. Hace daño en los vasos sanguíneos y en el endotelio vascular.

Toxinas que dañan la membrana atacando enzimáticamente

Estas pueden ser metaloproteasas dependientes de zinc, como la toxina de Bacteroide fragilis (BFT), o bien fosfolipasas.

La BFT es una metaloproteasa que se activa por cationes de Zinc. Su diana es la E-cadherina, y su acción es romper su porción extracelular, es decir, romper las uniones célula-célula del epitelio untestinal. La fosfolipasa α-toxina de Clostridium perfringens ataca a los fosfolípidos de la membrana rompiéndola al igual que ocurre con la fosfolipasa de Listeria monocytogenes.

Toxinas que no dañan la membrana

Se trata de toxinas que, al igual que las anteriores, actúan sobre la superficie celular, pero en este caso no dañan a la membrana. Lo que hacen es alterar el sistema de comunicación de la célula. Pueden ser de dos tipos:

  • Las toxinas termoestables (ST) de las ETEC (E. coli enterocolítica) son las STA y STB. Tienen naturaleza peptídica (≈ 20 aminoácidos) con estructura muy estable gracias a puentes disulfuro. Resisten hasta 100ºC durante 30 minutos. La más conocida es STA, que se une al receptor de la hormona guanilina, en células intestinales. Esta hormona regula la homeostasis en el riñón y el intestino. La unión al receptor activa a la guanilato ciclasa, que produce grandes cantidades de GMPc, un mensajero intracelular que provocara la salida de agua al exterior. La consecuencia es una fuerte diarrea.
  • Superantígenos: estas toxinas ocasionan una respuesta exagerada del sistema inmune, y un gran aumento de la producción de mediadores de la inflamación (IL-1, IL-8, IL-6 y TNF) que acaban dañando a los propios tejidos del hospedador. Los linfocitos T, con sus receptores T, son las células que reconocen a los antígenos. Los receptores van unidos al complejo principal de histocompatibilidad de tipo II (MHC, células presentadoras de antígenos). El superantígeno hace un crosslinking entre la región variable de la célula T y el complejo MHC tipo II sin necesidad del antígeno. Las bacterias productoras de estas toxinas son Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes.
mhc molecula

Toxinas que actúan en el interior de la célula hospedadora

Estas toxinas se pueden dividir en dos grupos:

  1. Las que se internalizan por endocitosis
  2. Las que se inyectan directamente.

Las que penetran por endocitosis son muy variadas funcionalmente pero comparten una estructura A/B: con un dominio encargado de reconocer el receptor en la célula hospedadora (B) y otro con actividad catalítica (A).

Ambos dominios suelen estar en un mismo polipéptido, que se modifica postraduccionalmente para permitir que el dominio tóxico se libere. Pueden estar estos dominios unidos por enlaces covalentes o no.

Algunas toxinas tienen estructura A/B5, con los dos dominios en distintos polipéptidos: 5 polipéptidos B unidos (pentámero) reconocen al receptor y el dominio tóxico A va unido a estos.

Tienen efectos variados en las células hospedadoras como se pueden apreciar en el esquema. A partir de estos efectos se pueden clasificar a las distintas toxinas:

  • Toxinas que inhiben la síntesis de proteínas
  • Toxinas que alteran la transmisión de señales,
  • Toxinas que interfieren la polimerización de la actina
  • Toxinas que interfieren el tráfico de vesículas de membrana

Toxinas que inhiben la síntesis de proteínas.

Las más conocidas son las siguientes:

Toxina diftérica DT de Corynebacterium diphtheriae: Pertenece al grupo de las que inhiben la síntesis de proteínas. Se trata de una bacteria Gram+ que produce una enfermedad generalmente en el tracto respiratorio de los niños, la difteria. El gen de su toxina DT se encuentra en un fago lisogénico, por lo que habrá cepas de esta bacteria lisogenizadas con este fago (toxigénicas) y cepas que no (no toxigénicas).

A veces el fago es críptico, es decir, que la bacteria lo posee pero está bloqueado por alguna mutación. De todas formas, las cepas no toxigénicas no son inocuas, porque pueden provocar otras enfermedades como faringitis o endocarditis.

La toxina DT consiste en un solo polipéptido con varias regiones funcionalmente diferentes: sitio de reconocimiento del receptor, sitio transmembrana y sitio catalítico. En la figura se muestra el mecanismo de entrada de la toxina con los dos dominio, en un caso unidos covalentemente y en otro no. El mecanismo de acción es el siguiente: la bacteria reconoce el factor de crecimiento epitelial EFG y la toxina entra por endocitosis dependiente de clatrina.

En el endosoma, la toxina se proteoliza separando el dominio catalítico del resto. Esto ocurre porque al bajar el pH en el endosoma (cuando madura), hay un cambio de conformación del dominio B (no catalítico) que aun estaba unido al A por puentes disulfuro y vuelve a la membrana. Este dominio B se puede ahora insertar en la membrana y provocar la translocación del dominio A catalítico (tóxico) al citoplasma, eliminándose ya por completo los puentes disulfuro para permitir su separación. El dominio B tiene una región T (de translocación) y una región R (reconocimiento del receptor)

toxina DT

La diana de esta toxina en el interior celular es el factor de elongación EF-2 de la síntesis de proteínas. Lo que hace el dominio tóxico A es añadir a la diftamida (un aminoácido modificado del factor de elongación) un grupo ADP-ribosa, inhibiéndolo. Esto hace que se interrumpa la formación de proteínas y la célula muera. La actividad de la toxina DT es entonces ADP-ribosilante.

La toxina diftérica es muy activa y posee una dosis letal muy baja. La actividad tóxica de la toxina DT se usa para hacer proteínas hibridas, por ejemplo, el dominio A de la toxina junto con la interleuquina 2. Lo que hace este hibrido es reconocer específicamente a linfocitos T, unirse a ellos, e introducir el dominio catalítico para matar la célula. Esta aplicación es muy importante para las células tumorales.

  • Exotoxina A: Esta toxina actúa de la misma manera que la anterior y tiene actividad ADP-ribosilante con el mismo factor de elongación.
  • Toxinas de la familia Shiga y Verotoxinas (en E. coli y Shigella dysenteriae): Estas toxinas rompen el enlace glicosilo entre la adenina y la ribosa en la subunidad 28S del ribosoma. Provoca una despurinificación del ARN ribosómico.

Transmisión de señales en células animales: receptores de superficie y proteínas intracelulares de transmisión de la señal.

Para entender la manera de actuar de estas toxinas que interfieren la transmisión de señales es importante comprender primero el sistema de señalización celular.

Los organismos pluricelulares necesitan que sus células se comuniquen entre ellas para actuar coordinadamente. El sistema de señales de coordinación entre células consta normalmente de proteínas receptoras que reciben la señal interna o externa y de proteínas de transmisión intracelular de la señal que la lleva al centro de respuesta donde están las proteínas efectoras o de respuesta.

En las células animales existen tres tipos de receptores de superficie:

  • Receptores asociados a canales iónicos. Suelen intervenir variando la permeabilidad de la membrana, como por ejemplo en la señalización de las células nerviosas mediante neurotransmisores.
  • Receptores asociados a proteínas G heterotriméricas. Poseen actividad enzimática (kinasa normalmente) que se activa con la señal, o bien están asociados a una enzima.
  • Receptores con actividad quinasa o asociados a quinasas. Regulan la actividad de una enzima que no está unida al receptor, sino que su relación esta mediada por una proteína G.
reconocimientos de toxinas

Las proteínas de transmisión de señal pueden activarse bien por fosforilación o bien por intercambio de GDP por GTP (activas con GTP).

intercambio de gdp por gpt toxinas

Señalización asociada a proteínas G heterotriméricas

Las proteínas G heterotriméricas constan de 3 péptidos: α, β, γ. Estos tres péptidos cuando forman el trímero mantienen desactivada la proteína con la subunidad α unida a GDP.

Cuando el ligando se une al receptor la proteína G se activa cambiando el GDP por GTP en la subunidad α. Estas proteínas G son el mediador del receptor con la enzima a la que va a afectar la toxina. Normalmente esas enzimas son productoras de segundos mensajeros en una cascada de señalización (normalmente AMPc y el Ca++) que afectaran a la señal celular.

Hay dos vías fundamentales de señalización: la vía de la adenilato ciclasa y la vía de la fosfolipasa C.

La proteína Gs heterodimérica es la más conocida y es la que activa a la adenilato ciclasa que a su vez induce la síntesis de AMPc. La Gi la inactiva.

Las toxinas que interfieren con este tipo de señalización pueden ser de dos tipos:

  • Con estructura A/B5, como la toxina colérica CT (colerae toxin) y las toxinas termolábiles LT1 y LT2 de EPEC (E. coli epitelial cell).
  • Con otra estructura: toxina pertúsica PT.

Toxina del cólera CT (Vibrio cholerae)

Esta bacteria se transfiere por infección alimentaria. Han de ingerirse unos 108-109 vibriones para sufrir la enfermedad. La toxina tiene una estructura A/B5. Su dominio B (de 5 polipéptidos iguales) se une al receptor de las células intestinales GM1, y transloca el dominio A. La porción tóxica A sufre una modificación postraduccional: A1 con actividad catalítica y A2 transmembrana.

La toxina sigue la vía del transporte retrogrado hasta el Golgi y el retículo endoplasmático, donde se separan ambas porciones del dominio tóxico, pasando A1 al citosol. Su diana es la subunidad α de la proteína Gs, la cual ADP-ribosila inhibiendo su actividad GTPásica.

Como consecuencia de ello, Gs está siempre activa, lo que provoca que se active constitutivamente la adenilato ciclasa, aumentando de forma incontrolada los niveles de AMPc. El AMPc activa a la proteinkinasa A, la cual fosforila los canales de Cl manteniéndolos abiertos, al mismo tiempo que se inhibe la entrada de Na, produciéndose una salida masiva de cloro a la luz intestinal.

Como consecuencia de ello se produce una salida masiva de agua para igualar las concentraciones internas y externas de solutos, lo que conlleva al organismo a sufrir fuertes diarreas.

toxina del cólera

La terapia del cólera se basa en la reposición de iones y la hidratación. El tratamiento antibiótico puede acortar la enfermedad por limitar el crecimiento de los V. cholerae, pero no tiene efecto en la toxina liberada.

Toxinas LT1 y LT2 (E. coli epitelial cell)

Actúan igual que la anterior pero más levemente. Son toxinas menos destructoras aunque son las responsables de las denominadas diarreas del viajero.

Toxina PT (Bordetella pertussis)

Esta toxina tiene una estructura distinta de A/B5. Presenta una estructura formada por polipéptidos diferentes: S2, S3, dos S4 y S5, y una subunidad catalítica S1 que tiene actividad ADP-ribosilasa. Su diana es una proteína G heterodimérica, en concreto la Gi. Esta proteína Gi tiene la función de inhibir a la adenilil ciclasa.

La actividad catalítica de la toxina ADP-ribosila a la subunidad α de Gi, impidiendo que pueda unirse a GTP. De esta manera inactiva a Gi, lo que conduce a la activación constitutiva de la adenilato ciclasa provocando un aumento de AMPc, como en las toxinas anteriores, pero en este caso no produce diarrea puesto que la bacteria infecta las células epiteliales del tracto respiratorio causando la tosferina por necrosis de las células.

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